南京泰立瑞
真正重要的是：在尽量保留组织结构的前提下，同时观察多个蛋白标志物，区分细胞类型、功能状态和组织区域，再把这些信息转化为可定量的单细胞与空间数据。
但随着标志物增加，传统免疫荧光很快会遇到几个问题：弱表达靶标看不清、同源一抗难以组合、荧光通道数量有限，以及不同通道之间可能发生光谱重叠。TSA（Tyramide Signal Amplification，酪胺信号放大）正是解决其中一部分问题的重要技术路线。
本文从原理、实验流程、Panel设计和空间生物学应用四个层面，系统梳理TSA多重免疫荧光。
一、TSA究竟放大了什么？
TSA是一种由HRP介导的局部信号沉积方法。
在一个典型反应中，一抗先与组织中的目标蛋白结合，携带辣根过氧化物酶（HRP）的检测体系再识别一抗。HRP在过氧化氢存在下催化带荧光基团的酪胺分子，使其转化为活性中间体，并沉积到目标附近的酪氨酸残基上。
图1｜TSA信号放大机制。 一抗定位目标，HRP催化荧光酪胺在目标附近沉积。图源：Åstrand，KTH学位论文，2022，Figure 4。
数个荧光基团的直接标记思路相比，TSA能够在目标附近沉积更多荧光分子，因此特别适合常规免疫荧光中信号偏弱的蛋白。
这里需要注意：TSA放大的是检测信号，不是目标蛋白本身，也不会自动提高抗体的特异性。如果一抗存在非特异结合，TSA同样可能把错误信号一起放大。
二、为什么TSA可以用于多重染色？
TSA多重染色的关键，不只是“信号更亮”，而是荧光酪胺沉积后能够留在组织上。
完成第一轮染色后，可以去除这一轮的一抗和HRP检测抗体，同时尽量保留已经沉积的荧光信号。随后更换另一种荧光酪胺，进行第二个标志物的染色。不断重复“染色—沉积—洗脱”的循环，就能在同一张切片上累积多个标志物。
这也为使用多支同源一抗提供了可能。每轮只引入一支目标一抗，并在进入下一轮前充分去除上一轮抗体，就能降低同源抗体同时存在时的交叉识别问题。
但“可以使用同源一抗”不等于天然不会串色。只要上一轮一抗或HRP没有去除干净，下一轮酪胺仍可能在上一轮位置继续沉积，形成跨通道污染。因此，洗脱效率验证是多轮TSA的必要质控项目。
三、一套TSA多重免疫荧光实验通常怎么走？
从项目视角看，TSA并不是从“加一抗”才开始。一个更完整的工作流包括以下八个环节。
1. 明确生物学问题
先确定研究究竟要回答什么：区分哪些细胞类型？观察哪些功能状态？比较哪些组织区域？最终需要细胞比例、共表达、距离、邻近关系，还是空间邻域？
如果这些问题没有提前明确，Panel很容易堆积大量“常见marker”，却缺少真正用于区分目标细胞或解释结果的关键标志物。
2. 评估样本条件
固定方式、固定时间、切片厚度和保存时间都会影响抗原状态及组织自发荧光。对于珍贵的FFPE样本，建议先用连续切片完成单标和条件优化，再进入正式多色实验。
EnkiLife的实操文章建议FFPE切片厚度控制在约4–5 μm，并强调固定不足可能造成组织松散和抗原丢失，固定过度则可能加重交联和表位遮蔽。这个范围可以作为起点，但仍需根据组织类型、实验室前处理流程和扫描系统验证，不能机械照搬。
3. 逐一完成单标验证
每支抗体都应先回答三个问题：
•阳性位置是否符合已知组织学分布？
•阴性区域和无一抗对照是否足够干净？
•信号是否落在扫描与定量的有效动态范围内？
单标不合格时，直接组合成多标Panel通常只会把问题变得更难定位。
4. 统一抗原修复条件
多重Panel中的所有抗体最终需要在同一张切片、同一套前处理框架内工作。某个抗体在单独的最佳修复条件下表现很好，并不意味着它能兼容整个Panel。
需要寻找的是“Panel共同可接受条件”，而不是每支抗体各自的理论最优条件。
5. 优化一抗与TSA反应
一抗浓度、孵育时间、HRP反应和酪胺浓度共同决定信号与背景。优化目标不是追求肉眼最亮，而是获得可重复、未饱和、可定量的信号。
6. 评估表位稳定性并安排顺序
不同抗原对反复加热、洗脱和化学处理的耐受性不同。对循环处理敏感或低丰度的靶标，通常需要更早染色；稳定且高表达的靶标，可以考虑放在后面的轮次。
7. 建立光谱与洗脱质控
需要检查单通道串色、组织自发荧光、光谱拆分、上一轮抗体残留和荧光信号饱和。只看最终merged图，很容易掩盖某个通道的问题。
8. 扫描与定量分析
完成染色只是起点。后续还需要图像质控、组织分区、细胞分割、marker定量、表型分类和空间分析。染色阶段缺少关键marker或出现串色，后期算法无法凭空补救。
一项肺癌7-marker Panel研究把这一过程概括为：抗体筛选、抗原修复评估、一抗浓度优化、表位稳定性与洗脱效率测试、顺序IF或TSA多重染色，以及最终图像分析。
图2｜从单标筛选到多重Panel的优化流程。 图中上方为顺序IF路线，下方为TSA/Opal路线。图源：Åstrand，2022，Figure 6。
四、Panel设计为什么不是把单标简单叠加？
该肺癌研究最初希望直接采用临床IHC中使用的抗体克隆，但部分克隆并不适合IF检测，最后需要重新筛选。研究总计评估了11支抗体克隆，形成包含TTF-1、Napsin A、CK7、Synaptophysin、INSM1、p40和CD56的最终Panel。
图3｜研究最终采用的7-marker抗体Panel。 这是一项特定研究的实验配置，不应直接作为其他实验的通用配方。图源：Åstrand，2022，Table 3。
更值得借鉴的不是这些具体克隆，而是它揭示的开发逻辑：
•IHC可用不等于IF可用；
•单标可用不等于多标兼容；
•厂家推荐稀释比只是起点；
•抗原稳定性会影响染色顺序；
•更换平台后，原有参数可能需要重新优化。
研究中TTF-1和Napsin A在第一次洗脱后信号明显下降，因此被安排在第一轮；CD56对洗脱较稳定，被安排在较后的轮次。这说明染色顺序应由表位稳定性、表达丰度和背景共同决定，而不应只按marker名单顺序排列。
五、TSA在空间生物学中解决什么问题？
TSA本身是一种染色与信号放大技术，并不等同于完整的空间分析平台。
它的价值在于：在组织结构仍然保留的切片上，为多个蛋白标志物提供可成像信号。随后通过数字病理扫描和图像分析，才能把荧光图转化为带空间坐标的细胞数据。
例如，一个肿瘤免疫微环境项目可能依次完成：
肿瘤与间质分区 → 细胞分割 → CD3、CD8、FOXP3、CD68、PD-L1等marker定量 → 细胞表型组合 → 细胞密度、共表达、最近邻和空间邻域分析
因此，TSA回答的是“如何在原位获得多个蛋白信号”，空间分析回答的是“这些细胞在哪里、与谁相邻、形成怎样的组织结构”。两者相互衔接，但不能混为一谈。
六、最常见的六类失败原因
1. 样本前处理不可比
不同样本固定时间差异过大，会造成抗原暴露和自发荧光不一致，后续即使使用同一染色参数，也未必具有可比性。
2. 单标尚未优化就进入多标
多标失败后很难区分是抗体本身、染色顺序、光谱还是洗脱造成的问题。
3. 只追求“亮”
信号过强可能发生饱和，掩盖细胞之间真实的表达差异，并增加邻近结构的背景。
4. 染色顺序只看表达量
表达丰度很重要，但表位对循环处理的稳定性同样重要。弱靶标通常优先，但仍需用实验验证。
5. 没有设置必要对照
无一抗对照、已知阳性组织、单通道对照和洗脱对照分别用于排查自发荧光、抗体失效、光谱串色和抗体残留，不能相互替代。
6. 染色与分析脱节
如果后续需要区分细胞类型，Panel必须提供足够的谱系marker；如果需要做空间邻近分析，图像分辨率、细胞分割和坐标数据必须在前期就纳入规划。
· 结语 ·
TSA多重免疫荧光的核心，不是把更多颜色堆到一张图上，而是在有限组织样本中获得稳定、特异、可拆分、可定量的多蛋白信号。
一个可靠的TSA项目通常遵循这样的顺序：
研究问题 → 样本与Panel规划 → 单标验证 → 抗原修复与抗体优化 → 表位稳定性和染色顺序 → 多轮染色与洗脱质控 → 扫描、细胞表型与空间分析
真正决定项目质量的，不只是试剂体系，而是整条工作流是否有证据、可复核、可重复。
有图像分析需求，欢迎添加微信
微信号｜igiveyes
小红书号｜泰立瑞空间组学
关注我们解锁 · 多重免疫荧光图像分析 · 干货
原文发布于“泰立瑞空间组学”微信公众号：查看原文