从高维图像到单细胞表型、空间邻域和可统计数据，CODEX 的真正挑战往往从“成像完成”之后才开始。

分析流程概念示意图，不代表具体样本、产品界面或实验结果

CODEX / PhenoCycler 等超多重成像技术，可以在同一张组织切片上获取数十个甚至更多蛋白 marker，同时保留细胞所在的位置和组织结构。

这意味着研究者不只能够知道“样本中有哪些细胞”，还可以继续追问：

• 这些细胞分别位于什么组织区域？

• 相同表型的细胞是否存在不同的功能状态？

• 哪些细胞彼此靠近，哪些细胞呈现空间排斥？

• 肿瘤核心、侵袭前沿、间质和 TLS 等结构如何被不同细胞群共同组织？

• 这些空间特征在不同样本或研究分组中是否存在差异？

但 marker 越多，分析并不会自动变得更简单。

● CODEX不是一张“通道更多的荧光图”

普通多重荧光已经需要处理背景、串色、细胞分割和表型判定；进入超多重场景后，通道数、细胞数和表型组合快速增加，任何一个前置步骤出现偏差，都可能在后续分析中被不断放大。

常见难点包括：

1. 通道多，背景和异常信号更复杂

不同 marker 的信号强度、定位模式和染色质量可能并不一致。部分通道还可能存在背景偏高、信号溢出、局部伪影或批次差异。

如果未经质量控制就直接进入聚类，技术噪声可能被误认为新的细胞亚群。

2. 细胞分割决定后面所有数据是否可信

CODEX 分析最终通常要落到单细胞层面。一个细胞的 marker 强度、形态特征、空间坐标和邻近关系，都依赖于细胞边界是否合理。

在淋巴组织、TLS、肿瘤浸润前沿等细胞密集区域，容易出现细胞粘连、过度分割、漏分割或核—胞对应错误。分割一旦偏移，后续表型和空间邻域也会建立在错误对象上。

3. marker 多，不等于表型自动清晰

超多重数据中，细胞身份往往不能只用一个阳性/阴性阈值决定。

既要结合 marker 表达，也要关注信号定位、细胞形态、组织区域和已知生物学逻辑。对于未知或难以预先定义的亚群，还需要通过无监督聚类、降维、表达热图和原图回看反复质控，而不是只看一张 UMAP 就完成命名。

概念示意：从原始多通道图像到细胞边界、表型聚类和组织原图回贴，需要在高密度区域持续进行质量检查；不代表真实实验结果。

完成细胞身份判定后，还需要继续查看功能相关 marker 及其空间背景。相同表型的细胞，仍可能处于不同的激活、抑制或增殖状态。将这些状态重新映射回原图，有助于判断差异来自生物学结构，还是阈值、分割或背景造成的假象。

概念示意：核心表型一致的细胞，仍可能因功能相关 marker、信号强度及局部微环境不同而呈现不同状态；不代表具体样本或实验结果。

4. 细胞比例无法替代空间结构

两个样本可能具有相似的 CD8⁺ T 细胞比例，但这些细胞在一个样本中深入肿瘤内部，在另一个样本中却主要停留在间质或肿瘤边缘。

仅比较数量，可能看不到这种组织结构差异。CODEX 的优势恰恰在于同时保留“细胞身份”和“空间位置”，因此分析不能停在细胞计数。

● 一条完整的 CODEX 分析流程

我们将 CODEX / PhenoCycler 图像分析组织为从“图像”到“细胞”，再到“空间结构和统计变量”的连续流程。

第一步：项目设计与数据质控

分析开始前，需要先明确：

• 样本类型、样本数量和研究分组；

• marker panel 及每个 marker 的预期定位；

• 图像格式、像素分辨率和扫描范围；

• 是否需要区分肿瘤、间质、TLS、血管周围等组织区域；

• 最终希望回答的是细胞组成、表型差异，还是空间关系问题。

随后逐通道检查背景、信号分布、异常区域和可用性。必要时进行背景处理、噪声过滤，并记录不可用或需要谨慎解释的通道。

第二步：单细胞分割与质量检查

结合 DAPI 核信号和可用的膜/胞质 marker，建立细胞核与全细胞对象。对于细胞密集区、弱膜区和复杂组织边界，需要重点回看分割轮廓。

这一阶段不仅输出细胞数量，还为每个细胞建立空间坐标和后续定量载体，是整条分析链路的底座。

第三步：marker 单细胞定量

在细胞对象上提取各通道信号，形成“细胞 × marker”的定量矩阵，并可结合细胞面积、形态和组织区域等信息，为表型识别准备结构化数据。

概念示意：每个细胞的 marker 定量结果与其组织坐标保持关联，使后续表型识别和空间分析能够回到原图复核；不代表具体软件界面或真实实验数据。

第四步：已知表型分类与未知亚群探索

对于已有明确 marker 逻辑的细胞类型，可以开展有监督表型分类；对于难以预先命名的群体，则可以通过无监督聚类发现潜在亚群。

可靠的表型流程通常需要经历：

1. 根据 marker 逻辑划分清晰大类；

2. 对未命名或需要细分的细胞进行聚类；

3. 结合 UMAP、表达热图和原图位置进行质控；

4. 根据生物学知识命名、合并或继续拆分；

5. 回到组织图像中验证空间分布是否合理。

第五步：从细胞表型进入空间分析

完成细胞身份确认后，可以根据研究问题选择不同层级的空间分析：

• 最近邻距离：目标细胞与哪类细胞更接近；

• 固定半径邻近分析：一定距离内有哪些细胞组合；

• 聚集与排斥分析：不同细胞群在多个距离尺度下的空间关系；

• 空间浸润与环带梯度：细胞是否进入目标区域，以及随边界距离如何变化；

• 空间邻域分析：局部区域由哪些细胞群共同组成；

• 空间热图与密度分析：细胞或指标在组织中的高低分布；

• 组织区域比较：比较肿瘤核心、间质、侵袭前沿、TLS 等区域；

• 细胞关系网络：描述不同细胞群的相对空间邻近模式。

需要注意，“细胞互作”类结果通常反映空间邻近或潜在关联，不能仅凭距离直接证明功能性生物学互作。

概念示意：不同空间方法回答不同层级的问题，应根据细胞类型、组织边界和统计目标选择，并结合原图与组间数据解释。

第六步：形成可统计、可复核的数据资产

最终结果不应只有几张好看的空间图。

更完整的交付可以包括：

• 细胞级 marker 定量矩阵；

• 细胞表型、空间坐标和组织区域信息；

• 各样本细胞数量、比例和密度统计；

• 距离、邻近、浸润和空间邻域指标；

• 分组比较所需的样本级汇总表；

• 分割、表型和空间分析可视化结果；

• ROI、分类结果及关键过程数据。

这样才能让分析结果回到原始图像中验证，也能继续用于后续统计建模、科研图表和研究假设验证。

● 从原始图像到空间数据矩阵：泰立瑞如何承接CODEX分析？

泰立瑞的CODEX分析解决方案，不是只提供某一个分割或聚类工具，而是把图像预处理、细胞分割、marker定量、表型识别、空间分析和结果交付串成连续流程。根据团队的软件基础、项目规模和交付需求，可以选择自主分析或项目制服务。

方案一：使用QuPath插件矩阵开展自主分析

对于希望自己掌握参数和分析过程的团队，可将泰立瑞QuPath插件矩阵组合到CODEX / PhenoCycler分析流程中：

• TR-NoiseX：用于图像预处理、通道检查和数据标准化；

• TR-Seg：结合核与膜/胞质信号建立细胞对象；

• TR-PhenoClass：按照已知marker逻辑开展细胞表型分类；

• TR-PhenoDiscover：通过聚类、降维和原图联动探索未知亚群并进行质控；

• TR-Spa：开展最近邻、空间浸润、空间邻域和组织区域比较等分析。

相关模块可结合QuPath云端分析环境使用，也可根据数据安全、样本规模和部署条件评估其他交付方式。

方案二：采用项目制CODEX图像分析服务

对于缺少专职图像分析人员、样本量较大，或希望直接获得结构化数据与科研图表的团队，泰立瑞可根据项目需求提供：

• 图像与 marker panel 评估；

• 通道质量检查、背景处理和图像预处理；

• 组织区域与 ROI 规划；

• 单细胞核及全细胞分割；

• 单细胞 marker 强度与形态特征提取；

• 已知 marker 规则下的表型分类；

• 无监督聚类、细胞亚群发现及质控；

• 细胞组成、比例、密度与共表达分析；

• 最近邻、聚集/排斥、空间浸润及环带梯度分析；

• 空间邻域、空间热图和细胞关系网络分析；

• 样本级汇总、组间统计及结果可视化；

• 分析过程数据、细胞矩阵和图表整理交付。

项目可结合泰立瑞自研图像分析软件、QuPath插件工具及云端分析流程开展。具体模块、交付内容和周期，需要根据图像质量、marker数量、细胞类型、ROI范围、样本规模和研究目标共同确定。

如果暂时不确定该选哪些空间分析方法，可以先提供一张代表性图像、完整marker panel、样本分组和研究问题。泰立瑞可先评估通道质量、分割条件、表型逻辑和空间分析可行性，再共同确定分析路径与交付边界。

● CODEX的价值，不只在marker数量

CODEX 给研究者带来的，不只是更多颜色，而是在同一组织空间中同时保留多维表型和细胞位置的机会。

真正有价值的分析，需要把这份信息依次转化为：

可信的细胞对象 → 可解释的细胞表型 → 可比较的空间结构 → 可复核的统计数据

让超多重图像不止“信息很多”，更能形成清晰、可信、可解释的科研结果。

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小红书号｜泰立瑞空间组学

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