空间转录组提供RNA表达与位置，mIF提供预选蛋白标记的图像信息。两类数据可靠对应后，可以进一步问：同一类细胞中，蛋白表型不同的群体是否呈现不同RNA特征？整体差异来自细胞组成，还是来自同类细胞的表达状态？
本文以ST-FFPE-mIF研究中的HER2分组为例，梳理这一分析思路。原研究采用同一FFPE切片上的联合检测，没有进行药物、光照或细胞因子刺激实验。刺激研究可以借鉴数据组织思路，但需要另外设计处理、对照与验证，不能把该论文当作刺激响应的实测证据。
把三类差异分开提问
| 问题 | 需要比较什么 | 需要警惕什么 |
|---|---|---|
| 细胞组成不同 | 以独立样本为基础比较目标细胞的数量、比例或密度。 | 整体RNA升高可能只是表达该基因的细胞变多。 |
| 同类细胞表达状态不同 | 在身份可比的目标细胞中比较RNA、基因集或其他预设指标。 | 细胞数量不能替代生物学重复，分组与批次可能影响结果。 |
| 差异出现在特定位置 | 保留区室与坐标，在各自组织内检查差异分布。 | 不同组织不能默认逐细胞一一对应，边界与取样范围需明确。 |
原论文实际怎样做HER2分组
Zhang等在同片空间转录组与mIF数据中提取已注释的上皮细胞，按HER2荧光强度分为低、中、高组，再比较高组与低组RNA表达并进行GSEA。研究观察到TNFα/NF-κB、IL2/STAT5和KRAS相关基因集的富集，展示了蛋白表型与转录信息的联合分析方式。
这里是按测得的蛋白信号分组，不是随机分配的处理与对照。样本内的细胞差异分析可产生探索性线索，但不应把大量细胞当作同等数量的独立样本，也不应把RNA富集直接写成已验证的功能激活。查看原研究Figure 5与方法。
一条可复核的分析路径
- 先确认样本关系和分析尺度：同片、相邻切片，或只能支持区域级对应。
- 完成图像、RNA质量与空间映射核对，记录分割、信号和RNA归属的不确定区域。
- 结合多个身份标记、RNA注释与形态建立可比细胞集合，保留未知或不稳定类别。
- 按预先说明的蛋白信号或样本组别分组，记录分组依据与参考组。
- 结合独立样本、批次、研究结构和多重检验要求选择比较方法。
- 将差异与基因集结果放回各自组织图像，形成待验证问题。
建议怎样组织结果表
| 层级 | 字段示例 | 目的 |
|---|---|---|
| 细胞 | sample_id、roi_id、cell_id、cell_type、蛋白信号组、RNA特征、坐标 | 保留表型、RNA和位置间的可追溯关系。 |
| 样本 | biological_sample_id、组别、批次、区室、目标细胞数量 | 明确独立重复与嵌套结构。 |
| 比较结果 | 细胞类型、比较组、效应方向、不确定性、多重检验结果、方法版本 | 解释统计口径，而非仅保留一张富集图。 |
上表是数据结构示例，不是软件导出的实测结果。只有一个样本时，应将结果限定为样本内探索；若要推断组间差异，需要与实验设计相符的独立生物学重复和统计方法。
如果研究问题确实涉及刺激实验
先完成处理组、对照组、取样时间及独立重复设计，再分别在每个样本内对应空间转录组与mIF，最后比较各样本中同类细胞。对FFPE切片而言，这通常是不同样本或取材时间点的比较，不是连续追踪同一个细胞。刺激也可能影响身份marker，需要防止把marker变弱误判为细胞消失。
通路富集可提示候选响应；是否涉及功能激活或因果，需要与研究问题相符的额外证据。空间共现本身也不能证明机制。
联合分析的背景与同片/相邻切片边界见空间转录组与mIF整合总览。已有图像、表达矩阵和研究设计时，可通过图像分析服务评估配准、分型与可支持的分析尺度。
蛋白图像对应及表型环节可了解TR-StainSync图像配准和TR-PhenoClass表型分析；RNA矩阵映射与统计方案仍需结合平台及样本设计评估。
参考文献与资料
- Zhang X, Zhang M, Xu Y, et al. ST-FFPE-mIF: integrating spatial transcriptomics and multiplex immunofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded tissues using Stereo-seq. Genome Biology. 2025;26:428. DOI: 10.1186/s13059-025-03900-3。主要参考Figure 5G–H及分组方法。
- Squair JW, et al. Confronting false discoveries in single-cell differential expression. Nature Communications. 2021;12:5692. DOI: 10.1038/s41467-021-25960-2。用于说明生物学重复与差异分析的推断层级。
内容整理：terrydr｜文献解读与联合分析方法。本文于2026年10月20日更新。文中引用研究的结果归原作者；教学示例与软件演示按图注说明。