两张肿瘤切片都检测到了 TLS，它们代表的免疫状态就一样吗？
不一定。
只记录“TLS 阳性”有点像只知道一座城市“有医院”：医院有几家、规模多大、离居民区多远、里面有哪些科室、是否真正运行良好，这些信息都还不知道。
TLS 也是如此。它不是一个单一 marker，也不是看到一团 B 细胞就能下结论。真正有价值的问题往往是：TLS 有多少、离肿瘤多远、由哪些细胞组成，以及这些细胞处于成熟、活化还是免疫抑制状态。
读图说明：TLS 分析可以拆成四层。数量与大小回答“有多少”；空间位置回答“在哪里”；细胞组成回答“里面是谁”；功能状态回答“它们正在做什么”。前三层是描述结构，第四层才逐渐接近免疫功能，但仍需要结合实验和临床数据验证。原创示意图，不代表具体研究数据。
■ TLS 到底是什么？
TLS 的英文是 tertiary lymphoid structure，通常译为“三级淋巴结构”。它是在慢性炎症、持续感染或肿瘤等环境中形成的异位淋巴样结构，不是人体原本就有的淋巴结。
一个相对成熟的 TLS 往往具有一定的组织性：可以看到 B 细胞聚集区、T 细胞区、树突状细胞、浆细胞，有时还会出现生发中心相关结构。但 TLS 并不是非黑即白的固定形态，而是可能经历从简单淋巴聚集到更有组织、更成熟结构的连续过程。
因此，研究 TLS 的第一步不是急着“数”，而是先说清楚：什么样的区域才被定义为 TLS？
■ 这篇论文怎样识别 TLS？
2025 年，Markovits 等发表了一项 HPV 分层的头颈鳞癌空间研究。研究纳入 16 例 FFPE 肿瘤样本，其中 7 例 HPV 阳性、9 例 HPV 阴性；使用 37-antibody 多重免疫荧光 panel，分割超过 250 万个细胞，并识别 14 类细胞和多个组织空间区域。
论文中的 TLS 不是由一个 marker 直接圈出来的，而是经过多步规则识别：
1.先寻找 CD21+ B 细胞和树突状细胞高密度、面积达到要求的生发中心区域；
2.再识别富含 B 细胞、CD4 T 细胞、树突状细胞和浆细胞的淋巴聚集体；
3.将生发中心向外扩展 100 μm，与淋巴聚集体求空间交集；
4.交集区域超过 20,000 μm²时，才被归入 TLS；
5.与最近肿瘤区域相距超过 1,000 μm 的结构被排除，以减少把非肿瘤相关成熟淋巴组织纳入分析的可能。
读图说明：上方依次展示生发中心、淋巴聚集体和最终识别的 TLS；黄色区域为算法标出的 TLS。下方示意论文如何根据 TLS 内细胞到最近肿瘤区域的平均距离，将其分为肿瘤邻近 TLS（ta-TLS）和远端 TLS（d-TLS）。该图为论文 Fig. 5A 裁切，颜色仅对应论文的通道和分割标注。
这套定义很重要，因为它告诉我们：TLS 识别依赖 marker panel、细胞表型、空间聚集、面积和组织位置的共同约束。
但也要注意，500 μm²、100 μm、20,000 μm²和后面的 200 μm等阈值，都属于这项研究的具体分析方案，不能不加验证地复制到所有癌种和项目。
■ 为什么只看数量可能得不到答案？
研究在 HPV 阳性组的 7 例样本中有 4 例检测到 TLS，在 HPV 阴性组的 9 例样本中也有 4 例检测到 TLS。两组的“TLS 阳性率”看起来并没有形成简单的有无差异。
从识别出的结构数量看，HPV 阳性肿瘤共有 29 个 TLS，HPV 阴性肿瘤共有 11 个。按 TLS 阳性样本计算，平均数为 7.25 对 2.75，但 p=0.11，只能称为趋势；TLS 大小也没有显著组间差异。
如果文章写到这里就停下，很容易变成“HPV 阳性似乎 TLS 更多”。但这既不是最稳定的结果，也没有解释这些 TLS 可能发挥什么作用。
■ 比数量更明确的差异，是它离肿瘤多远
论文继续计算 TLS 内细胞到最近肿瘤区域的平均距离。结果显示，HPV 阳性组 TLS 的平均距离约为 173 μm，HPV 阴性组约为 279 μm，差异达到统计学显著（p=0.03）。
研究还发现，HPV 阳性 TLS 中落在邻近肿瘤间质区域的细胞比例更高，平均为 39.7%，HPV 阴性组为 14.4%（p=0.02）。
读图说明：B 图纵轴是 TLS 与最近肿瘤区域的平均距离，红色代表 HPV 阳性、蓝色代表 HPV 阴性；红色虚线标示约 200 μm 的分组位置。C 图比较每个 TLS 中有多少细胞位于邻近肿瘤间质（aTS）。箱线图显示分布范围，黑点代表单个 TLS，而不是独立患者，因此结果仍需回到患者层级谨慎解释。该图为论文 Fig. 5B-C 裁切。
距离本身不能证明 TLS 一定在促进抗肿瘤免疫，但它提供了重要空间背景：一个紧贴肿瘤边界的免疫组织，与一个远离肿瘤的淋巴聚集体，接触的抗原、肿瘤细胞和间质环境可能不同。
■ 同样叫 TLS，里面的细胞状态也可能不同
论文进一步比较了 TLS 的细胞组成和 marker 状态。
HPV 阳性 TLS 更常见 ICOS+ CD4 T 细胞、CD45RO+ 记忆 T 细胞、CD21+ B 细胞和 CD19+ 浆细胞等特征，整体更接近免疫活化和成熟的图景。
HPV 阴性 TLS 则出现更多巨噬细胞、粒细胞、Treg，以及 PD-1+/PD-L1+ T 细胞相关的抑制性特征。换句话说，两组即使都被标记为“TLS 阳性”，内部免疫生态也可能并不相同。
读图说明：左侧 A-C 展示 TLS 的识别、与肿瘤的距离及邻近间质比例；右上 D 比较不同细胞类型在 TLS 中的比例；E 的火山图比较肿瘤邻近 TLS 和远端 TLS 中的细胞状态；F 给出 HPV 阳性/阴性、肿瘤邻近/远端 TLS 的代表性多重免疫荧光图像。阅读时应先看比较对象，再看横轴方向、marker 标签和显著性，不能只根据颜色多少判断“好”或“坏”。
■ 规划 TLS 项目，染色前先回答四个问题
如果准备做 TLS 多重免疫荧光研究，可以在设计 panel 前先写下四个问题：
第一，怎样定义 TLS？ 是只识别淋巴聚集体，还是要求 CD21+ 生发中心和一定面积？
第二，准备比较什么？ 是 TLS 阳性率、每张切片数量、面积，还是患者分组差异？
第三，是否研究空间位置？ 如果要分析肿瘤邻近性，必须先有可靠的肿瘤区域和 TLS 边界分割，并明确距离从哪里量到哪里。
第四，是否讨论成熟或功能状态？ 如果要讨论活化、记忆、耗竭或免疫抑制，panel 中就不能只有 B/T 细胞身份 marker，还要提前纳入相应状态 marker。
■ 把 TLS 问题落到图像上，泰立瑞能做什么？
只找到 TLS 还不够。真正需要回答的是：它在哪里、里面有哪些细胞、这些细胞处于什么状态。
泰立瑞基于 QuPath + 空间分析插件，可以帮助科研团队：
·准确分割 TLS 等细胞密集区域；
·识别 B 细胞、T 细胞、浆细胞、巨噬细胞等细胞类型；
·分析 TLS 与肿瘤的距离、细胞邻域和空间分布；
·将多重免疫荧光图像整理成可统计、可比较、可展示的结果。
已有多重免疫荧光图像，或正在规划 TLS 项目？ 欢迎联系泰立瑞，沟通 panel 与空间分析方案。
需要注意：这项研究样本量较小，且缺少抗 PD-1 治疗结局，相关发现还不能用于预测疗效。
研究 TLS，不能只数数量，更要看它在哪里、由谁组成、处于什么状态。