肺癌组织做完多重免疫荧光，拿到一张彩色 merged 图，就能直接做出论文里的空间分析图吗？
答案是：通常还差很远。
一篇2025年发表在《Science Advances》的非小细胞肺癌研究，使用 33-marker 多重免疫荧光分析了约 150 万个细胞。
研究者没有只选一个“最好看”的视野，而是从 50 位患者的肿瘤组织中进行多区域取样，共分析了 255 个组织芯片点位。每位患者至少选择两个不同的约 1 mm² 肿瘤区域，用来尽量观察肿瘤内部的空间异质性。
从组织切片到论文里的空间图，这项研究实际经历了 6 个关键环节。
第一步
先确定取哪些组织区域
图1 从取样到空间分析
同一块肺癌组织里，肿瘤细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维细胞的分布可能差异很大。
如果只选一个视野，看到的可能只是肿瘤的一小部分；如果选了多个区域，却在统计时把它们当成多个患者，又会造成统计上的伪重复。
所以 ROI 怎么选、每位患者取几个区域、最后如何汇总，必须在分析前确定。
第二步
用33 个 marker 定义“谁是谁”
论文使用的 panel 包括：
- 19 个细胞谱系 marker
- 6 个共刺激或抑制 marker
- 4 个免疫信号 marker
- 4 个组织结构 marker
根据这些 marker 的组合表达，研究者把约 150 万个细胞分成了 13 类，包括肿瘤细胞、细胞毒性 T 细胞、辅助性 T 细胞、调节性 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞和血管相关细胞等。
图2 marker与细胞表型
这里的难点不只是“把 marker 染出来”，而是这些 marker 能不能稳定地组合成目标细胞表型。
一旦表型规则不可靠，后面的细胞比例、邻近关系和空间图都会一起受影响。
第三步
把荧光图变成单细胞数据
空间分析不是直接在彩色图片上完成的。
首先要完成细胞分割，再为每个细胞记录：
- marker 表达
- 细胞类型
- x、y 空间坐标
- 所属组织区域
- 所属 ROI、样本和患者
只有把图像转换成带坐标的单细胞数据表，后面才有可能计算距离、邻近关系和局部细胞群落。
第四步
观察每个细胞周围
这篇论文以每个细胞为中心，统计周围 50 μm 内的细胞组成，再通过无监督聚类识别出 8 类空间邻域，包括：
- 肿瘤细胞富集邻域
- 肿瘤细胞与淋巴细胞混合邻域
- 淋巴细胞混合邻域
- 巨噬细胞富集邻域
- 细胞毒性 T 细胞富集邻域
- 成纤维细胞富集邻域
- 单核细胞富集邻域
- 血管细胞富集邻域
图3 八类空间邻域
这一步回答的已经不是“CD8 有多少”，而是：
CD8 周围主要是肿瘤细胞、抗原呈递细胞，还是成纤维细胞？
论文还把每个细胞所属的空间邻域重新映射回组织位置。这样可以直接看到，不同肺癌样本中的局部微环境并不是均匀混合的，而是形成大小、位置和组成不同的空间区域。
图4 空间邻域回到组织原位
第五步
继续分析细胞关系和距离
针对接受免疫治疗的患者，论文进一步比较了不同细胞之间的空间关系。
在这项研究的 mIF 子队列中，治疗响应者肿瘤里的细胞毒性 T 细胞比例为 9.5%，非响应者为 3.8%。
但更值得注意的是空间位置：
- 响应者中的细胞毒性 T 细胞更频繁地邻近肿瘤细胞
- 树突状细胞与细胞毒性 T 细胞的空间邻近更明显
- 非响应者中的细胞毒性 T 细胞更常邻近成纤维细胞
- 响应者中的细胞毒性 T 细胞富集邻域比例为 7.8%，非响应者为 1.2%
图5 两组细胞邻近网络
图6 两组空间邻域示例
这些结果提示，除了细胞数量，细胞处于怎样的局部微环境同样值得分析。
但要注意：空间邻近只能提示潜在关系，不能单独证明两个细胞正在发生功能互作。
第六步
把多个ROI汇总回患者层面
一位患者可能有多个组织芯片点位，但这些点位不能被当成多个独立患者。
论文把多个区域的空间指标汇总到患者层面，再进行组间比较、生存分析和响应关联分析。
研究者还比较了平均数、中位数和最大值等汇总方法，发现不同方法会明显影响最终模型表现。
这说明，ROI 怎么汇总并不是简单的数据整理，而是分析设计的一部分。
看完这篇论文会发现，一张空间图背后真正需要完成的是：
组织取样
↓
多重染色
↓
图像质控与细胞分割
↓
marker定量与细胞表型
↓
50 μm空间邻域
↓
细胞关系和距离
↓
患者层级统计
其中任何一环没有提前设计好，都可能在后期造成返工。例如：
- panel 缺少关键 marker，无法区分目标细胞
- 图像失焦或串色，影响阳性判断
- 细胞分割错误，导致距离和邻域同时偏移
- ROI 选择没有规则，难以比较不同样本
- 只保留结果图，没有单细胞坐标和参数，后续无法复核
所以，如果准备开展肺癌多重免疫荧光研究，最好在染色前就把这些信息放在一起：
组织类型 + 研究问题 + 样本量与分组 + marker panel + ROI 方案 + 目标论文图表。
如果已经拿到图像，也可以先提供一张代表图、panel、样本结构和想做的空间图，评估现有数据能够支持哪些细胞表型、空间指标和统计分析。
图像分析服务的价值不只是把软件流程跑完，而是帮助项目从研究问题开始，把染色、图像、单细胞数据、空间指标和最终论文图表连接起来，并提前发现可能影响结果的环节。
本文数据和结果来自特定非小细胞肺癌研究队列，仅用于拆解科研方法，不应直接用于其他样本的疗效预测或临床判断。