循环TSA把目标marker分配到多个成像轮次，再将真实采集的通道映射到共同坐标。配准的作用是建立位置对应，数字整合的作用是保存和展示各轮信号；两者都不会生成未检测的marker，也不能弥补缺失组织。本文讨论逐轮成像的循环方案，常规TSA原理见TSA总览。
先把染色轮次、成像轮次和通道分开
一个成像轮次可以包含多个依次染色的marker，不能将“每轮成像两种颜色”写成“两种抗体同时随意混染”。教学安排可以是第1轮A/B、第2轮C/D、第3轮E/F，每轮另保留共同参照；实际顺序及处理必须按体系验证。
| 对象 | 需要确认什么 | 不能混淆什么 |
|---|---|---|
| 抗体和HRP相关残留 | 前轮结合或酶活性是否会影响后轮检测 | 处理了抗体不代表去掉已沉积的荧光。 |
| 前轮荧光信号 | 在新一轮中如何去除、隔离或控制其贡献 | 荧光变化也不能替代抗体/HRP处理验证。 |
这两项要求应结合共同参照保留、抗原敏感性和组织稳定性一起验证。不同TSA体系和循环策略并不共享一套通用温度、时长或淬灭配方。常见异常及对照见TSA质控专题。
选择参考轮次与共同参照
先选组织完整、成像清楚且能覆盖主要分析区域的参考轮次，再确认各轮是否有可靠共同参照，如经过验证的核信号或稳定结构。应记录像素尺度、图像方向、通道顺序和轮次文件对应，避免图像已对齐但marker命名错位。
不能只看整片轮廓重合
| 位置或问题 | 检查内容 |
|---|---|
| 全片及组织边缘 | 整体位移、旋转、组织保留范围与裁切差异。 |
| 细胞密集区与腺体 | 核、细胞和边界是否局部错位；参考通道是否可比较。 |
| 折叠、裂缝、组织脱落 | 标记为不可用或无对应，不能依靠变形填补缺失组织。 |
| 局部误差记录 | 用预先定义的地标或标注集合评估；报告单位、位置分布及排除规则。 |
没有实测地标时，不给出“达到某个μm”的精度结论。实际效果需要看原始图像、共同参照及局部复核，不能从概念叠图推定误差、成功率或通用可用性。
整合后的数据应保留什么
- 参考图、各轮变换及共同可用区域，保留原始图像而非只导出合并截图。
- 独立marker通道、轮次及通道映射表、像素尺度和质控标记。
- 需要联合表型时，固定可复核的细胞边界，并检查来自不同轮的信号归属。
- 继续输出细胞强度、表型和空间指标时，保留样本/ROI/患者映射及参数版本。
软件自主处理与项目协作
TR-StainSync图像配准提供官网介绍和演示入口，配准后可结合TR-PhenoClass表型分析与TR-Spa组织空间解码继续分析。代表图可先看官网现有配准操作演示，它不代表本文循环TSA数据的实测验证。
已有多轮图像的项目，可通过图像分析服务提供每轮原图、共同参照、marker对应和研究目标，先评估组织与图像条件，再确定可用范围、输出文件和后续分析。
参考文献与资料
- Cell Signaling Technology. Fluorescent Multiplex Immunohistochemistry with Tyramide Signal Amplification (TSA). 在线协议，页面标注2025年9月发布，核对日期2026-10-20。常规TSA说明不能直接作为任意循环荧光处理协议。
- Akoya Biosciences. Opal Multiplex IHC Assay Development Guide and Image Acquisition Information. 官方PDF（2021/12路径版本），核对日期2026-10-20。
内容整理：泰立瑞｜本文于2026年10月20日更新。文献结果归原研究作者；教学模板、分析建议和软件介绍按文中说明使用。